细胞质粒DNA/siRNA转染

实验步骤

1. 取对数生长期的293T细胞，用胰蛋白酶消化计数，调整细胞密度2×105细胞/孔，接  种到六孔板中，置于37℃的CO2培养箱中，培养过夜；

2.第二天，待细胞密度达到30-50％时，更换Opti-MEM培养基，转染孔，每孔750uL,非转染孔，每孔1mL,接着进行转染操作：

 （1）取出质粒DNA/siRNA,短暂离心，1OD的质粒siRNA加入125uL的DEPC H2O重悬，室温静置5min,轻轻混匀离心，溶解后浓度为:20uM，备用。

 （2）取出Lipofectamine® 2000，至于室温中，并轻轻混匀，备用。

 （3）各取125uL的Opti-MEM培养基，加入到2个1.5mL无菌EP管中，向其中一管，加入 150pmol(7.5uL)的siRNA/2ug质粒DNA,另一管中，加入7.5uL 的Lipofectamine® 2000，轻轻混匀后,在室温下孵育5min。

 (4) 孵育5min后，立即将稀释的质粒DNA/siRNA和稀释的Lipofectamine® 2000,轻轻混合，在室温下孵育20min，以便于质粒DNA/siRNA- Lipofectamine® 2000复合物的形成。溶液可能出现混浊，但是这不会影响转染。

 （5）孵育20min后，立即将质粒DNA/siRNA- Lipofectamine® 2000复合物加入到对应板孔中，置于37℃的CO2培养箱中。

 （6）培养6h后（可以根据细胞转染时具体状态，适当调整转染时间），更换成完全培养基，继续培养24-72h,收取细胞，进行qPCR检测，选取最佳的转染序列或者评价具体的转染效率。