慢病毒感染贴壁细胞

1.细胞准备

以293T细胞为例,将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为3×105/mL， 500uL/孔，每孔的细胞数量约为1.5×105个，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30%至50%之间。放入37℃, 5% CO2,培养箱中培养过夜。

2.病毒感染

我们推荐1/2小体积感染法，即病毒感染时，加入1/2体积新鲜培养液，慢病毒感染4h后补足至培养体积。

24孔板的培养液体积为500uL，1/2培养体积为250uL。

感染前，从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，根据摸索的MOI值,加入合适的病毒进行感染(每孔加病毒量(ul) =MOl x细胞数/病毒滴度（TU/mL) ×1000)。需要加入polybrene的细胞，可同时加入适量polybrene。慢病毒感染4h后补足至完全培养体积。

 3.换液

感染后第二天(约24h)，吸去含有病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。

4.观察荧光

感染后48 h，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜初步观测GFP表达效率。一般感染后72h可达到表达高峰。对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株

特殊细胞的感染注意事项

1.感染悬浮细胞

感染悬浮或半悬浮细胞，则需要通过平角离心转染法，即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口，放入平角离心机，低速（200×g）离心1 h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限，没有平角离心机，可用离心管代替，将细胞吹打吸入离心管中，进行低速离心，去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液，室温放置15 min(尽量不要超过30 min)，然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染过夜即可。

2.对于极难感染的细胞

对于极难感染的细胞，如DC(树突状细胞）等，可采用多次感染的方法，即感染24 h后,更换新鲜病毒进行二次感染,可显著提升感染效率。

3.传代能力较差的原代细胞

对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用滴度更高的腺病毒进行感染。

构建慢病毒稳转株

( puromycin筛选即使用带有puromycin抗性的病毒感染目的细胞，使目的细胞具有puromycin抗性。之后再利用puromycin药物处理感染后的细胞，从而筛选出成功感染病毒的细胞。

1.确定puromycin的最适合浓度

   puromycin的建议工作浓度为1~10ug/mL。在筛选之前，需摸索能够杀死空细胞的最低puromycin浓度:可将细胞铺24孔板，使第二天融合率约为50~60%，24h后更换含不同浓度puromycin 的完全培养基(可先文献查询细胞的puromycin浓度，再设置合理的浓度梯度)。

puromycin梯度可设置为(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0ug/mL 处理48h，选取能够杀死90%以上空细胞的最低浓度进行后续实验。

3.进行puromycin筛选

筛选时，请设置未感染病毒的空细胞对照实验组，并加入等量浓度的puromycin.

慢病毒感染48-72h后，感染效率约在80%左右时，并在细胞汇合度在60-70%时，以摸索到的puromycin浓度进行处理(具体以细胞状态而定，细胞状态稳定后加)。加药约48h观察对照组空细胞的死亡情况，若空细胞组细胞死亡率达90%以上，撤掉puromycin换新鲜的培养基培养。后期可根据空细胞的生长速度进行定期药筛。

4.筛选细胞的放大培养

  puromycin筛完后，待细胞长满可按适当比例传代培养，等到扩增到一定的细胞数量后即可进行单克隆稳定株筛选或混合克隆稳定株筛选。